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四種蛋白含量測定方法比較

發(fā)布時(shí)間: 2022-06-24  點(diǎn)擊次數(shù): 4457次

蛋白質(zhì)是一切活細(xì)胞和有機(jī)體的最重要和最必需的組成成分,它是構(gòu)成人體及所有動(dòng)物機(jī)體組織干物質(zhì)的主要部分。例如,人體按總量計(jì)算,干重54%是蛋白質(zhì),即除去水分后,蛋白質(zhì)約占體重的一半左右,可見蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)中最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

       蛋白質(zhì)是由二十種氨基酸以肽鍵相互聯(lián)接而成的復(fù)雜的高分子化合物,它水解的最終產(chǎn)物是氨基酸。在蛋白質(zhì)分子內(nèi)又通過氫鍵、鹽鍵、疏水作用力構(gòu)成蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),即蛋白質(zhì)的構(gòu)象( conformation )。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子受到某些物理、化學(xué)因素影響時(shí),它的空間結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生改變或破壞,物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)也隨著發(fā)生變化,稱為蛋白質(zhì)的變性作用。因此在研究蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能時(shí),應(yīng)防止它的變性作用。

       蛋白質(zhì)在溶液中的分子大小,溶解度,電荷,吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等各不相同,根據(jù)這些因素,可以選擇一定的方法分離,制備和鑒定蛋白質(zhì)。利用蛋白質(zhì)肽鏈末端基的特點(diǎn),還可以設(shè)計(jì)特殊的分析技術(shù)來測定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

       氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位,它也是生物體維持生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì),具有特殊的生理作用,參與生物機(jī)體的代謝。因此對(duì)氨基酸的分離測定在實(shí)際工作中也是重要的。

       蛋白質(zhì)含量可從它們的物理化學(xué)性質(zhì),如折射率、比重,紫外吸收、染色等測定而得知;或用化學(xué)方法,如定氮、雙縮脲反應(yīng)、 folin﹣酚試劑反應(yīng)、BCA法等方法來測定。其中 Folin ﹣酚試劑法和考馬斯亮藍(lán)染色法是一般實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常使用的方法。而 Folin﹣酚試劑法靈敏度較高,較紫外吸收法靈敏10~20倍,而較雙縮脲法靈敏100倍左右。這類方法操作簡便、迅速,不需要復(fù)雜和昂貴的設(shè)備,又能適合一般實(shí)驗(yàn)室的要求,若作一般測定較為適宜。

       一、雙縮脲法

          1.原理

         在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物,其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比,而與蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍1~10mg蛋白質(zhì)。

         雙縮脲法于需要快速但并不需要十分精確的測定。硫酸銨不干擾此呈色反應(yīng),使其有利于對(duì)蛋白質(zhì)純化早期步驟的測定。

         干擾此測定的物質(zhì)包括在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖劑,例如 Tris 緩沖液,因?yàn)樗鼈兘o予陽性呈色反應(yīng)。Cu2+也容易被還原,有時(shí)發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)紅色沉淀。

         2.器材

        蛋白的提取(可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果適當(dāng)調(diào)整樣本量及比例) ①組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:(5-10)的比例(建議稱取 0.1 g 組織,加 入 1 mL 提取液)處理樣品,冰浴勻漿,4℃ 10000 rpm 離心 10 min,取上清置于冰上待測。 ②細(xì)菌或細(xì)胞:離心收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL) 為(500-1000):1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1 mL 提取液)處理樣品,冰浴超聲破碎(功 率 300 W,超聲 3 s,間隔 7 s,總時(shí)間 3 min),4℃ 10000 rpm 離心 10 min,取上清置于冰上待測。 ③液體樣本:澄清無色液體樣品可以直接或使用提取液適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定。

       測定過程中所需要的儀器和試劑:可見分光光度計(jì)、1 mL 玻璃比色皿、研缽/勻漿器、可調(diào)式移 液器、臺(tái)式離心機(jī)和蒸餾水。

       3.注意事項(xiàng)

         待測樣本蛋白濃度須在 0.5-10 mg/mL 范圍內(nèi),正式測定應(yīng)取 1-2 個(gè)差異樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),確保 蛋白濃度在此范圍內(nèi),低于 0.5 mg/mL 則不能使用此法測定,高于 10 mg/mL 或吸光值大于 0.4 應(yīng)使用 Extract Solution 適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定,計(jì)算時(shí)相應(yīng)修改。

       二、Folin﹣酚試劑法(Lowry法)

       1.原理

       用于蛋白質(zhì)測定的 Lowry 反應(yīng)是雙縮脲方法的發(fā)展,Lowry 蛋白含量檢測法是通過蛋白質(zhì)與銅離子在堿性條件下生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物,進(jìn)一步將 Folin 試劑還原生成深藍(lán)色化合物,產(chǎn)物在 650 nm 處具有特征吸收峰,通過吸收值的變化即可定量檢 測樣品蛋白濃度。

       這個(gè)測定法較雙縮脲法靈敏得多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子同樣容易干擾Lowry反應(yīng),而且對(duì)后者的影響還要大得多。所測蛋白質(zhì)樣品中若含酚類及檸檬酸均有干擾作用。濃度較低的尿素(約0.5%左右)、胍(0.5%左右)、硫酸鈉(1%)、硝酸鈉(1%)、三氯乙的酸(0.5%)、乙的醇(5%)、(5%)、丙酮(0.5%)等溶液對(duì)顯色無影響,這些物質(zhì)濃度高時(shí)必須做校正曲線。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。

       2.器材

       分光光度計(jì)    恒溫水浴

       3.檢測方法優(yōu)勢

       ①移液器移取少量液體時(shí)的誤差,會(huì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線低濃度點(diǎn)造成影響,樣品點(diǎn)應(yīng)落在標(biāo)準(zhǔn)線 1/2 后;

       ②BSA Standard Solution 4℃保存有效期 3 個(gè)月,-20℃保存有效期一年,其他試劑室溫保存有效 期一年,試劑開封使用后請(qǐng)及時(shí)密閉保存;

       ③Lowry 法定量范圍為 50-500 µg/mL,F(xiàn)olin 試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起, 樣品若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用,不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使 顯色強(qiáng)度稍有不同;

       三、考馬斯亮藍(lán)染色法(Bradford法)

       1.原理

       1976年 Bradford 建立了用考馬斯亮藍(lán) G -250與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理,迅速、敏感的定量測定蛋白質(zhì)的方法。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起染料最大吸收的改變,從465nm變?yōu)?95nm,光吸收增加。蛋白質(zhì)﹣染料復(fù)合物具有高的消光系數(shù),因此大大提高了蛋白質(zhì)測定的靈敏度,最大低檢出量為1ug蛋白。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合是很迅速的過程,大約只需2分鐘,結(jié)合物的顏色在1小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。一些陽離子,如 K+ , Na+, Mg2+ ,( NH4)2SO4,乙的醇等物質(zhì)不干擾測定,而大量的去污劑如 TritonX -100, SDS 等嚴(yán)重干擾測定,少量的去污劑可通過用適當(dāng)?shù)膶?duì)照而消除。以下試劑對(duì)考馬斯亮藍(lán) G -250-蛋白質(zhì)復(fù)合物有影響:1mol/LKCL、5mol/NaCL、1mol/LMgCL2、2mol/LTris、0.1mol/LEDTA、1mol/L(NH4)2SO4、99%乙的醇、5%酚、丙酮、0.1%TritonX-100、1%TritonX-100、0.1%SDS、1%SDS。由于染色法簡單迅速,靈敏度高,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測定。

       2.器材

       分光光度計(jì)     微量注射器

       檢測方法優(yōu)勢

       Bradford 法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響,樣品中巰基乙的醇的濃度可 高達(dá) 1 M,二硫蘇糖醇的濃度可高達(dá) 5 mM;但受略高濃度的去垢劑影響,需確保樣品中 SDS 濃度低 于 0.1%,TritonX-100 低于 0.1%,Tween 20、60、80 低于 0.06%;

       四、BCA法

       1.產(chǎn)品描述

       BCA(Bicinchonininc Acid)蛋白含量檢測法是用于總蛋白質(zhì)定量的常用方法,BCA 與二價(jià)銅離 子混合即為 BCA 工作液,蛋白在堿性條件下能夠?qū)?Cu2+還原為 Cu+,Cu+與 BCA 試劑可形成紫色絡(luò) 合物,產(chǎn)物在 562 nm 處具有特征吸收峰,通過吸光值變化即可定量檢測樣品的蛋白濃度。

       2.注意事項(xiàng)

       ①Copper Solution 與 PBS Diluent 可置于 2-8℃長期保存,若發(fā)現(xiàn)污染渾濁則應(yīng)丟棄;BCA Solution 在低溫條件下出現(xiàn)結(jié)晶沉淀時(shí),可 37℃溫育使其*溶解,不影響使用;

       ②為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作;

       檢測方法優(yōu)勢

       ③BCA 法測定蛋白含量不受絕大部分樣品中化學(xué)物質(zhì)的影響,樣品中 5% SDS、5% Triton X-100、 5% Tween20、60、80 等常用濃度去垢劑不影響檢測結(jié)果,但 EDTA 和 EGTA 等螯合劑、DTT 和巰基 乙的醇等還原劑和脂類會(huì)影響檢測結(jié)果,需確保 EDTA 低于 10 mM、無 EGTA、二硫蘇糖醇低于 1 mM、 巰基乙的醇低于 0.01%;若樣品含有較多干擾物質(zhì)且本身背景值較高,建議使用 Bradford 法蛋白含量檢測試劑盒(Cat AKPR015);

       ④若蛋白濃度較低時(shí)(小于 50 μg/mL),可將顯色溫度提高至 60℃且待測樣本

與工作液比例調(diào)整 為 1:8 進(jìn)行測定,能夠明顯提高靈敏度至 5 μg/mL;

       ⑤為保證結(jié)果準(zhǔn)確且避免試劑損失,測定前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書(以實(shí)際收到說明書內(nèi)容為準(zhǔn)), 確認(rèn)試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備是否充分,操作步驟是否清楚,且務(wù)必取 2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本進(jìn)行預(yù)測定,過程中問題請(qǐng)您及時(shí)與工作人員聯(lián)系。


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